Plasmide CRISPR d'Activation (h) nephrocystin-3: sc-406788-ACT

NPHP3 code la néphrocystine‑3, une protéine associée aux cils qui se localise au cil primaire et dans la région centrosomale, où elle contribue à la ciliogenèse, à la signalisation ciliaire et au maintien de la polarité épithéliale. La néphrocystine‑3 participe à des complexes protéiques situés au niveau de la zone de transition du cil, qui régulent le trafic des récepteurs de signalisation et influencent des voies telles que Hedgehog et Wnt, dépendantes de l’intégrité de la fonction ciliaire. La perturbation des processus dépendants de NPHP3 peut altérer la mécanoperception et la signalisation du développement dans les épithéliums rénal et autres, ce qui relie son étude aux mécanismes des ciliopathies. Ainsi, NPHP3 constitue une cible utile pour étudier la transduction de signaux médiée par les cils, la tubulogenèse et les relations génotype‑phénotype dans des modèles cellulaires humains.

nephrocystin-3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de NPHP3 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

nephrocystin-3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus NPHP3 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription NPHP3, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de nephrocystin-3. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus NPHP3 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de nephrocystin-3 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie nephrocystin-3 dans les cellules tumorales présentant une expression de NPHP3 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.