Plásmido CRISPR de Activación (m) nephrin: sc-424905-ACT

El gen Nphs1 de ratón codifica la nefrina, una proteína transmembrana de la superfamilia de las inmunoglobulinas que constituye el núcleo del diafragma de hendidura de los podocitos y es esencial para la integridad de la barrera de filtración glomerular. La nefrina participa en complejos multiproteicos con podocina y CD2AP, y se conecta con la remodelación del citoesqueleto de actina a través de vías de señalización que incluyen PI3K/AKT y quinasas de la familia Src, lo que favorece la supervivencia y la arquitectura de los podocitos. La alteración de la expresión o la localización de la nefrina desorganiza la estructura del diafragma de hendidura, lo que provoca cambios en la permeabilidad y fenotipos asociados a proteinuria, ampliamente estudiados en modelos de enfermedad renal. Como marcador enriquecido en podocitos, la regulación de Nphs1 se investiga con frecuencia en estudios sobre el desarrollo glomerular, las respuestas al daño y el mantenimiento de la barrera de filtración.

nephrin El plásmido de activación CRISPR (m) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de Nphs1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

nephrin El plásmido de activación CRISPR (m) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus Nphs1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional Nphs1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de nephrin. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo Nphs1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de nephrin en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía nephrin en células tumorales con expresión de Nphs1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.