Plásmido CRISPR de Activación (m) NEDL2: sc-435931-ACT

El gen Hecw2 de ratón codifica NEDL2, una ligasa E3 de ubiquitina de tipo HECT que regula el recambio proteico y la salida de señalización mediante el control dependiente de ubiquitina de la estabilidad y la localización de sus sustratos. La actividad de NEDL2 contribuye a la proteostasis y puede influir en vías que gobiernan el desarrollo neuronal, la función sináptica y la transcripción sensible al estrés, al modular la ubiquitinación de proteínas reguladoras clave. Debido a su papel en la regulación mediada por ubiquitina, Hecw2 se estudia en el contexto de fenotipos del neurodesarrollo y del comportamiento, así como de mecanismos más amplios de señalización por ubiquitina desregulada. Esto convierte a Hecw2 en una diana útil para analizar cómo las ligasas E3 ajustan las transiciones del estado celular y la señalización a nivel de red en modelos celulares de ratón.

NEDL2 El plásmido de activación CRISPR (m) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de Hecw2 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

NEDL2 El plásmido de activación CRISPR (m) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus Hecw2 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional Hecw2, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de NEDL2. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo Hecw2 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de NEDL2 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía NEDL2 en células tumorales con expresión de Hecw2 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.