NEDD4-L Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403647-ACT

NEDD4L codifica a NEDD4-L, uma ligase E3 de ubiquitina do tipo HECT que regula a renovação de proteínas ao catalisar a transferência de ubiquitina para substratos específicos de membrana e citosólicos. É mais conhecida por controlar a abundância e o tráfego do canal epitelial de sódio (ENaC) na superfície celular, relacionando a atividade da NEDD4-L ao transporte iônico, à homeostase de fluidos e às respostas celulares ao estresse. A NEDD4-L também se cruza com vias de sinalização, incluindo TGF-β/SMAD e Wnt/β-catenina, por meio da modulação dependente de ubiquitina de componentes dessas vias, influenciando a diferenciação celular e o remodelamento tecidual. Alterações na expressão ou na função de NEDD4L têm sido associadas à desregulação do manuseio de sódio e a programas de sinalização aberrantes implicados na biologia de doenças cardiometabólicas e fibróticas.

NEDD4-L O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de NEDD4L sem alterar a sequência de ADN subjacente.

NEDD4-L O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus NEDD4L em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição NEDD4L, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de NEDD4-L. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus NEDD4L nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de NEDD4-L no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via NEDD4-L em células tumorais com expressão de NEDD4L silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.