NECAP 2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-409444-ACT

NECAP2 kodiert NECAP 2, ein endozytotisches Adapterprotein, das im clathrinvermittelten Transport angereichert ist und an AP-2 sowie akzessorische Faktoren bindet, um die Reifung beschichteter Gruben (coated pits) und das Uncoating von Vesikeln zu koordinieren. Über seine Interaktionen mit FCHo-/Eps15-bezogenen Modulen und AP-2-regulatorischen Schaltkreisen beeinflusst NECAP 2 die Cargoselektion, die Internalisierung von Rezeptoren und die Recycling-Dynamik, die die Signaltransduktion an der Plasmamembran prägt. Diese Prozesse überschneiden sich mit Signalwegen, die den Umsatz von Wachstumsfaktorrezeptoren, synaptisches und neuronales Membran-Remodeling sowie zelluläre Stressantworten steuern, die mit einem Ungleichgewicht im Membrantransport verknüpft sind. Veränderte Endozytose und die Funktion von Adapterproteinen werden in der Krebsbiologie und Neurobiologie häufig untersucht, da sie die Rezeptorverfügbarkeit, die Signalstärke und die Membranhomöostase beeinflussen.

NECAP 2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen NECAP2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

NECAP 2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des NECAP2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der NECAP2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen NECAP 2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native NECAP2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von NECAP 2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des NECAP 2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem NECAP2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.