Plásmido CRISPR de Activación (h) NDH II: sc-402757-ACT

El DHX9 humano codifica la helicasa DExH-box NDH II, una helicasa multifuncional de ARN/ADN que regula la transcripción, el procesamiento del pre-ARNm, la exportación del ARNm, la traducción y el mantenimiento de la estabilidad del genoma. NDH II participa en el metabolismo de los R-loops y resuelve ácidos nucleicos estructurados, lo que la vincula con la señalización de la respuesta al daño del ADN y con las vías de estrés replicativo. Mediante interacciones con complejos ribonucleoproteicos y con ácidos nucleicos asociados a promotores, DHX9 puede influir en programas de expresión génica de la inmunidad innata y sensibles al estrés. La actividad o expresión alteradas de DHX9 se han asociado con un procesamiento de ARN desregulado y con inestabilidad ligada a la cromatina observada en múltiples contextos celulares relevantes para enfermedades, lo que respalda su uso como diana mecanística en genómica funcional.

NDH II El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de DHX9 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

NDH II El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus DHX9 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional DHX9, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de NDH II. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo DHX9 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de NDH II en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía NDH II en células tumorales con expresión de DHX9 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.