Plásmido CRISPR de Activación (h) NCCT: sc-402965-ACT

SLC12A3 codifica NCCT (NCC), un cotransportador electroneutro de Na⁺/Cl⁻ localizado en la membrana apical de las células epiteliales del túbulo contorneado distal, donde media la reabsorción de sodio y cloruro y contribuye a la homeostasis electrolítica y a la regulación de la presión arterial. La actividad de NCCT se integra con redes renales de manejo de sal que involucran la señalización de quinasas WNK–SPAK/OSR1, la cual modula la fosforilación, el tráfico y la abundancia del transportador en membrana. La variación genética o la expresión alterada de SLC12A3 se asocia con tubulopatías hereditarias con pérdida de sal, como el síndrome de Gitelman, y se ha investigado en el contexto de la susceptibilidad a la hipertensión y de fenotipos renales de electrolitos. Como transportador enriquecido en riñón, NCCT constituye un nodo abordable para estudiar el transporte iónico epitelial, la polaridad celular y la señalización osmorreguladora en sistemas modelo humanos.

NCCT El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de SLC12A3 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

NCCT El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus SLC12A3 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional SLC12A3, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de NCCT. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo SLC12A3 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de NCCT en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía NCCT en células tumorales con expresión de SLC12A3 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.