NCCT CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402965-ACT

SLC12A3 kodiert den NCCT (NCC), einen elektroneutralen Na⁺/Cl⁻-Kotransporter, der in der apikalen Membran von Epithelzellen des distalen gewundenen Tubulus lokalisiert ist. Dort vermittelt er die Rückresorption von Natrium und Chlorid und trägt zur Elektrolythomöostase sowie zur Regulation des Blutdrucks bei. Die NCCT-Aktivität ist in renale Netzwerke der Salzhandhabung eingebunden, an denen die WNK–SPAK/OSR1-Kinase-Signalgebung beteiligt ist, die Phosphorylierung, Trafficking und Membranverfügbarkeit des Transporters moduliert. Genetische Varianten oder eine veränderte Expression von SLC12A3 werden mit erblichen salzverlierenden Tubulopathien wie dem Gitelman-Syndrom in Verbindung gebracht und wurden im Kontext einer Hypertonie-Anfälligkeit sowie renaler Elektrolyt-Phänotypen untersucht. Als in der Niere stark angereicherter Transporter bietet NCCT einen gut zugänglichen Ansatzpunkt, um epithelialen Ionentransport, Zellpolarität und osmoregulatorische Signalwege in humanen Modellsystemen zu untersuchen.

NCCT Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen SLC12A3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

NCCT Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des SLC12A3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der SLC12A3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen NCCT-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native SLC12A3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von NCCT-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des NCCT-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem SLC12A3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.