NAGAT CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401118-ACT

ABO kodiert eine A/B‑Glykosyltransferase‑Aktivität, die üblicherweise als N‑Acetylgalactosaminyltransferase (NAGAT) bezeichnet wird. Es handelt sich um ein im Golgi-Apparat lokalisiertes Enzym, das terminale Kohlenhydratmodifikationen am H-Antigen katalysiert und so die Blutgruppendeterminanten A und B erzeugt. Über die Regulation der Biosynthese von Glykokonjugaten beeinflusst ABO die Glykosylierungsmuster an der Zelloberfläche, die den Transport von Membranproteinen, die Zell‑Zell‑Erkennung sowie Interaktionen mit Lektinen und Immunmediatoren mitbestimmen. Variationen in ABO-abhängigen Glykanstrukturen wurden mit veränderten hämostatischen und inflammatorischen Phänotypen in Verbindung gebracht, unter anderem durch Effekte auf Glykoproteine wie den von‑Willebrand‑Faktor und weitere Plasmaproteine. Diese Eigenschaften machen ABO/NAGAT zu einem nützlichen Modell, um glykosylierungsabhängige Mechanismen zu untersuchen, die für die Gefäßbiologie, Wirt‑Pathogen‑Interaktionen und die Immunregulation in menschlichen Zellen relevant sind.

NAGAT Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ABO-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

NAGAT Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ABO-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ABO-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen NAGAT-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ABO-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von NAGAT-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des NAGAT-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ABO-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.