myocilin Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401843-ACT

Il gene umano **MYOC** codifica la miocilina, una glicoproteina extracellulare secreta arricchita nei tessuti oculari che contribuisce all’organizzazione della matrice extracellulare, all’adesione cellulare e alla modulazione della dinamica del citoscheletro. La miocilina è associata ai processi di controllo qualità del reticolo endoplasmatico e, quando è mal ripiegata, può influenzare la proteostasi e la segnalazione da stress, con effetti sulla secrezione e sul rimodellamento della matrice. Alterazioni dell’espressione di **MYOC** o della gestione della proteina sono state collegate a una disfunzione del deflusso dell’umore acqueo e del trabecolato, rendendola rilevante per gli studi dell’omeostasi della pressione intraoculare. Queste funzioni collocano **MYOC** all’interfaccia tra le vie della matrice extracellulare, il traffico vescicolare e le risposte cellulari allo stress utilizzate per indagare la biologia cellulare oculare.

myocilin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di MYOC senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

myocilin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus MYOC nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione MYOC, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di myocilin. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus MYOC nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da myocilin nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via myocilin nelle cellule tumorali con espressione di MYOC silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.