Plasmide CRISPR d'Activation (h) MYH3: sc-400555-ACT

MYH3 code la chaîne lourde de myosine embryonnaire du muscle squelettique, un composant essentiel du moteur du filament épais qui convertit l’hydrolyse de l’ATP en force contractile. Il joue un rôle central dans la myofibrillogenèse et l’organisation des sarcomères au cours de la myogenèse précoce, en coordonnant les interactions actine–myosine nécessaires à la formation et à la maturation des fibres musculaires. L’expression de MYH3 s’intègre aux programmes transcriptionnels du développement et aux voies d’assemblage du cytosquelette qui façonnent l’architecture musculaire et les propriétés contractiles. Les variations génétiques ou une expression dérégulée de MYH3 ont été associées à des maladies congénitales du développement du muscle squelettique, caractérisées par une contractilité altérée et une organisation musculosquelettique anormale, ce qui en fait une cible pertinente pour l’étude des myopathies du développement.

MYH3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de MYH3 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

MYH3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus MYH3 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription MYH3, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de MYH3. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus MYH3 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de MYH3 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie MYH3 dans les cellules tumorales présentant une expression de MYH3 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.