mTOR CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400140-ACT

MTOR kodiert mTOR, eine Serin/Threonin-Kinase, die Nährstoffverfügbarkeit, Wachstumsfaktor-Signale, den zellulären Energiestatus und Stresssignale integriert, um anabole und katabole Programme zu koordinieren. Als katalytischer Kern von mTORC1 und mTORC2 reguliert mTOR die Proteinsynthese über S6K und 4E-BP1, die Lipid- und Nukleotidbiosynthese, Autophagie, lysosomale Funktion, die Organisation des Zytoskeletts sowie das Zellüberleben über Signalwege, die sich mit der PI3K–AKT-Signalübertragung überschneiden. Eine strenge Kontrolle der mTOR-Aktivität ist essenziell für Zellwachstum, Stoffwechsel und immunologische Homöostase, während eine Fehlregulation häufig mit veränderter Proliferation, metabolischer Umprogrammierung und aberranter Autophagie einhergeht. Gestörte MTOR-Signale wurden mit vielfältigen krankheitsrelevanten Kontexten in Verbindung gebracht, darunter Krebsbiologie, neuroentwicklungsbezogene und neurodegenerative Prozesse sowie metabolische und entzündliche Phänotypen.

mTOR Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen MTOR-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

mTOR Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des MTOR-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der MTOR-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen mTOR-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native MTOR-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von mTOR-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des mTOR-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem MTOR-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.