Plasmide CRISPR d'Activation (h) MTMR8/9: sc-413097-ACT

MTMR9 code une protéine de la famille des myotubularines qui participe à la signalisation des phosphoinositides par le biais d’interactions avec des myotubularines catalytiquement actives, influençant l’équilibre cellulaire entre le phosphatidylinositol 3-phosphate et le phosphatidylinositol (3,5)-bisphosphate. Via ces voies dépendantes des lipides, des complexes associés à MTMR8/9 sont impliqués dans le trafic endosomal, le remodelage membranaire et la régulation en aval de processus liés à la détection des nutriments et à l’autophagie. MTMR9 a été associé à des phénotypes métaboliques et à des contextes de signalisation liés à l’insuline dans des études génétiques et fonctionnelles, et une expression altérée a été rapportée dans des jeux de données associés à des maladies, notamment le cancer. Ces caractéristiques font de MTMR9 une cible utile pour étudier le contrôle, dépendant des phosphoinositides, de la dynamique vésiculaire et de la régulation de l’état cellulaire.

MTMR8/9 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de MTMR9 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

MTMR8/9 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus MTMR9 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription MTMR9, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de MTMR8/9. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus MTMR9 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de MTMR8/9 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie MTMR8/9 dans les cellules tumorales présentant une expression de MTMR9 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.