Msx-2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403657-ACT

Das humane MSX2 kodiert den Homeobox-Transkriptionsfaktor Msx-2, einen nukleären Regulator, der entwicklungsbiologische Signale integriert, um Entscheidungen über Zellschicksal, Proliferation und Differenzierungsprogramme zu steuern. Msx-2 wirkt nachgeschaltet von BMP/TGF-β und steht in Wechselwirkung mit Wnt- und FGF-Signalwegen, um epithel–mesenchymale Interaktionen, die kraniofaziale und Extremitätenmusterung, osteogene Differenzierung sowie die Zahnentwicklung zu koordinieren. Eine fehlregulierte MSX2-Aktivität wurde mit aberranter Knochenbildung und kraniofazialen Phänotypen in Verbindung gebracht; zudem wird eine veränderte Expression in Kontexten beschrieben, die abnormales Gewebe-Remodelling und die Festlegung von Zelllinien betreffen. Als transkriptioneller Repressor bzw. Aktivator – abhängig von Kofaktoren – wird Msx-2 häufig hinsichtlich seines Einflusses auf den Chromatinzustand und nachgeschaltete Gennetzwerke untersucht, die die Morphogenese steuern.

Msx-2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen MSX2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Msx-2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des MSX2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der MSX2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Msx-2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native MSX2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Msx-2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Msx-2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem MSX2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.