MRCKβ CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403169-ACT

CDC42BPB kodiert das mit der myotonen Dystrophie‑Kinase verwandte Cdc42‑bindende Protein Beta (MRCKβ), eine Serin/Threonin‑Kinase, die stromabwärts von GTPasen der Rho‑Familie, insbesondere CDC42, wirkt und die Aktin‑Myosin‑Kontraktilität sowie das zytoskelettale Remodeling reguliert. MRCKβ phosphoryliert Substrate wie die Myosin‑Leichtkette und LIMK und beeinflusst dadurch die Bildung von Stressfasern, Membrandynamik, Zellpolarität und gerichtete Migration. Über diese Funktionen verknüpft CDC42BPB die Rho‑GTPase‑Signalgebung mit Signalwegen, die den Umschlag von Zelladhäsionen und morphogenetische Veränderungen steuern. Eine fehlregulierte MRCKβ‑Aktivität und veränderte CDC42BPB‑Expression wurden mit aberranten Programmen der Zellbeweglichkeit in Verbindung gebracht, die für Modelle von Krebsinvasion und Metastasierung relevant sind, sowie auch mit breiteren Kontexten der Gewebeumgestaltung und entzündlichen Mikroumgebungen.

MRCKβ Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CDC42BPB-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

MRCKβ Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CDC42BPB-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CDC42BPB-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen MRCKβ-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CDC42BPB-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von MRCKβ-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des MRCKβ-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CDC42BPB-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.