Plasmide CRISPR d'Activation (h) MOB1B: sc-416280-ACT

MOB1B (MOB kinase activator 1B) code un coactivateur conservé des kinases LATS1/2 au sein de la voie de signalisation Hippo, soutenant des cascades de phosphorylation qui régulent l’activité de YAP/TAZ, les programmes transcriptionnels et le contrôle de la croissance dépendant du contact. En modulant la voie Hippo, MOB1B contribue à la progression du cycle cellulaire, à l’apoptose et au maintien de l’homéostasie tissulaire. La perturbation des composants de Hippo, y compris les régulateurs de la famille MOB, est associée à des phénotypes de prolifération et de migration altérés, fréquemment étudiés dans le contexte de la signalisation oncogénique et de l’intégrité épithéliale. MOB1B est donc pertinent pour explorer les interactions entre voies (cross-talk) avec les réseaux MAPK, PI3K-AKT et de remodelage du cytosquelette qui influencent les décisions de destinée cellulaire.

MOB1B Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de MOB1B sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

MOB1B Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus MOB1B dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription MOB1B, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de MOB1B. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus MOB1B natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de MOB1B au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie MOB1B dans les cellules tumorales présentant une expression de MOB1B silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.