Plasmide CRISPR d'Activation (h) MLL: sc-401307-ACT

KMT2A (MLL) code une méthyltransférase des lysines des histones contenant un domaine SET, qui catalyse la méthylation de H3K4 afin de réguler l’accessibilité de la chromatine et les programmes transcriptionnels contrôlant le développement hématopoïétique et la spécification du destin cellulaire. MLL agit au sein de grands complexes nucléaires qui coordonnent l’écriture épigénétique avec l’élongation transcriptionnelle au niveau des promoteurs et des enhancers, influençant des voies telles que la régulation des gènes HOX, les réponses aux dommages de l’ADN et la différenciation. La dérégulation de KMT2A, via une expression altérée ou des réarrangements génomiques, est fortement associée à des états transcriptionnels aberrants dans les leucémies et d’autres cancers, faisant de MLL un nœud central pour l’étude du contrôle épigénétique de l’expression génique oncogénique. Son rôle étendu dans la régulation médiée par la chromatine justifie également l’exploration d’effets dépendants du contexte sur la prolifération, l’engagement de lignée et la stabilité des réseaux transcriptionnels dans les cellules humaines.

MLL Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de KMT2A sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

MLL Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus KMT2A dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription KMT2A, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de MLL. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus KMT2A natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de MLL au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie MLL dans les cellules tumorales présentant une expression de KMT2A silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.