MITF Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400401-ACT

O fator de transcrição associado à microftalmia (MITF) é um fator de transcrição bHLH-LZ determinante de linhagem que regula programas que controlam o desenvolvimento, a pigmentação, a sobrevivência e a diferenciação de melanócitos. Em células humanas, o MITF integra sinais de vias como MAPK/ERK e cAMP/PKA para coordenar a transcrição de genes envolvidos na biogênese de melanossomos, nas respostas ao estresse oxidativo, na função lisossomal e no metabolismo celular. A atividade desregulada do MITF tem sido associada a estados celulares melanocíticos alterados, distúrbios de pigmentação e à biologia do melanoma, em que mudanças nas redes transcricionais dependentes de MITF podem influenciar proliferação, invasão e adaptação ao estresse. Como um nó transcricional central, o MITF é amplamente utilizado como ferramenta molecular para estudar identidade celular, plasticidade transcricional e regulação gênica dependente de sinalização.

MITF O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de MITF sem alterar a sequência de ADN subjacente.

MITF O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus MITF em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição MITF, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de MITF. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus MITF nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de MITF no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via MITF em células tumorais com expressão de MITF silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.