Plásmido CRISPR de Activación (h) MISP: sc-409029-ACT

El MISP humano (posicionamiento del huso mitótico) codifica una proteína asociada a actina y microtúbulos que contribuye a la orientación del centrosoma y del huso, a la progresión mitótica y al mantenimiento de la arquitectura epitelial. MISP integra la remodelación del citoesqueleto con el control del ciclo celular coordinando la dinámica de la actina cortical, la señalización vinculada a las adhesiones focales y la formación correcta del huso bipolar para favorecer una segregación cromosómica precisa. La desregulación del posicionamiento del huso y de la organización del citoesqueleto se asocia ampliamente con la inestabilidad cromosómica y la alteración de la polaridad tisular, lo que convierte a MISP en una diana relevante para estudiar mecanismos que acoplan adhesión, polaridad y división. En investigación biomédica, la modulación de la expresión de MISP se utiliza para evaluar la fidelidad mitótica, el control de la forma celular y las dependencias de vías de señalización en modelos celulares humanos transformados y no transformados.

MISP El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de MISP sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

MISP El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus MISP en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional MISP, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de MISP. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo MISP y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de MISP en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía MISP en células tumorales con expresión de MISP silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.