Plasmide CRISPR d'Activation (h) MEL-1B-R: sc-401526-ACT

MTNR1B code le récepteur humain de la mélatonine 1B (MEL-1B-R), un récepteur couplé aux protéines G de type rhodopsine qui transmet les signaux de la mélatonine afin de réguler la synchronisation circadienne et la physiologie dépendante de la photopériode. L’activation du récepteur se couple principalement aux protéines Gi/o pour moduler l’activité de l’adénylate cyclase, la signalisation cAMP/PKA et des programmes transcriptionnels en aval qui coordonnent les rythmes métaboliques cellulaires. L’activité de MTNR1B est liée à la régulation endocrine et métabolique, notamment la fonction des îlots pancréatiques et l’homéostasie du glucose, ce qui la rend pertinente pour l’étude des interactions entre rythmes circadiens et métabolisme. Des variations génétiques et d’expression de MTNR1B ont été associées à des altérations de paramètres glycémiques et à une susceptibilité accrue aux dysfonctionnements métaboliques, ce qui étaye son utilisation comme nœud mécanistique en chronobiologie et en recherche cardiométabolique.

MEL-1B-R Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de MTNR1B sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

MEL-1B-R Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus MTNR1B dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription MTNR1B, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de MEL-1B-R. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus MTNR1B natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de MEL-1B-R au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie MEL-1B-R dans les cellules tumorales présentant une expression de MTNR1B silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.