MEL-1A-R CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401075-ACT

MTNR1A kodiert den Melatoninrezeptor 1A (MEL-1A-R), einen Gi/o-gekoppelten GPCR, der zelluläre Antworten auf Melatonin sowohl in zentralen als auch in peripheren Geweben vermittelt. Die Rezeptoraktivierung unterdrückt typischerweise die Adenylatcyclase-Aktivität, moduliert die cAMP/PKA-Signalübertragung und kann MAPK/ERK- sowie PI3K-gekoppelte Signalwege beeinflussen. Dadurch werden Transkriptionsprogramme geprägt, die die zirkadiane Zeitsteuerung und die neuroendokrine Regulation koordinieren. Die MTNR1A-Signalgebung trägt zur Kontrolle von Schlaf‑Wach‑Rhythmen, der Funktion der Reproduktionsachse und der metabolischen Homöostase bei; veränderte Expression oder Rezeptorsignalgebung wird mit Phänotypen einer zirkadianen Fehlanpassung in Verbindung gebracht und ist in entsprechenden neuropsychiatrischen und metabolischen Krankheitsforschungskontexten relevant. Als Membranrezeptor mit definierten ligandenabhängigen Signalausgängen wird MTNR1A häufig genutzt, um GPCR‑Kopplung an Signalwege, Rezeptordesensibilisierung/-internalisierung und durch die innere Uhr kontrollierte Gen-Netzwerke zu untersuchen.

MEL-1A-R Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen MTNR1A-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

MEL-1A-R Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des MTNR1A-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der MTNR1A-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen MEL-1A-R-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native MTNR1A-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von MEL-1A-R-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des MEL-1A-R-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem MTNR1A-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.