MEK kinase-3 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404290-ACT

Humanes MAP3K3 kodiert MEK-Kinase-3 (MAP3K3), eine Serin/Threonin-MAP-Kinase-Kinase-Kinase, die vorgelagerte Signale von Zytokinrezeptoren, Toll-like-Rezeptoren und zellulärem Stress integriert und die Signalweiterleitung über MAPK-Kaskaden vermittelt. MAP3K3 trägt zur Regulation von NF-κB- und MAPK-getriebenen Transkriptionsprogrammen bei, die Entzündung, Zellüberleben, Differenzierung und Zytoskelettdynamik beeinflussen. Über diese Netzwerke wirkt MAP3K3 auf Endothel- und Immunzellantworten ein, einschließlich Signalwegen, die mit angiogener Signalgebung und Aktivierung der angeborenen Immunität verknüpft sind. Eine fehlregulierte MAP3K3-Aktivität und veränderte Signalwegverschaltung wurden mit entzündlichen Zuständen und onkogenen Signalkontexten in Verbindung gebracht, was MAP3K3 als Knotenpunkt für mechanistische Signalwegstudien nützlich macht.

MEK kinase-3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen MAP3K3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

MEK kinase-3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des MAP3K3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der MAP3K3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen MEK kinase-3-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native MAP3K3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von MEK kinase-3-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des MEK kinase-3-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem MAP3K3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.