MDA5 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401962-ACT

IFIH1 kodiert MDA5, eine zytosolische DExD/H-Box-RNA-Helikase, die als Mustererkennungsrezeptor für lange doppelsträngige RNA dient, die während einer Virusinfektion entsteht. Nach der Bindung von RNA oligomerisiert MDA5 und signalisiert über MAVS, um TBK1/IKKε, IRF3/IRF7 und NF-κB zu aktivieren, wodurch Transkriptionsprogramme für Typ‑I‑Interferone und proinflammatorische Antworten angestoßen werden. Diese Achse der angeborenen Immunität überschneidet sich mit der JAK‑STAT-Signalgebung und prägt antivirale Restriktion, Zytokinnetzwerke und die Antigenpräsentation. Eine fehlregulierte IFIH1/MDA5-Aktivität wurde mit interferongetriebenen entzündlichen Phänotypen und genetischen Assoziationen mit Autoimmunität in Verbindung gebracht, was IFIH1/MDA5 zu einem häufigen Ziel mechanistischer Studien zur angeborenen Erkennung und Immunhomöostase macht.

MDA5 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen IFIH1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

MDA5 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des IFIH1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der IFIH1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen MDA5-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native IFIH1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von MDA5-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des MDA5-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem IFIH1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.