Plasmide CRISPR d'Activation (h) MCM6: sc-402146-ACT

MCM6 code un composant central du complexe hélicase MCM2–7, qui autorise les origines de réplication de l’ADN et assure la progression des fourches de réplication pendant la phase S. En coordonnant l’activation des origines et les réponses au stress réplicatif, MCM6 contribue à la stabilité du génome via des voies liées au contrôle des points de contrôle (checkpoints) et à la signalisation des dommages à l’ADN. Une expression dérégulée de MCM6 ou une activité hélicase altérée est fréquemment associée à une prolifération aberrante, au stress réplicatif et à l’instabilité chromosomique observés dans de multiples contextes cancéreux. En tant que facteur couplé à la prolifération, MCM6 est largement utilisé comme point d’entrée moléculaire pour étudier le contrôle du cycle cellulaire, la dynamique de réplication et les mécanismes de maintien du génome dans les cellules humaines.

MCM6 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de MCM6 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

MCM6 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus MCM6 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription MCM6, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de MCM6. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus MCM6 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de MCM6 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie MCM6 dans les cellules tumorales présentant une expression de MCM6 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.