MC2-R Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402854-ACT

MC2R codifica il recettore della melanocortina 2 (MC2-R), un recettore accoppiato a proteine G che rappresenta il principale recettore dell’ormone adrenocorticotropo (ACTH) nella corteccia surrenale. In seguito al legame con il ligando, MC2-R si accoppia a Gs per stimolare l’adenilato ciclasi, aumentare i livelli di cAMP e attivare programmi trascrizionali dipendenti da PKA che regolano gli enzimi steroidogenici e la fisiologia surrenalica. L’attività di MC2R si integra con le vie di segnalazione delle melanocortine e con i pathway della biosintesi degli steroidi surrenalici che controllano la produzione di glucocorticoidi e le risposte allo stress. La disregolazione o la perdita di funzione di MC2R è associata a una ridotta responsività all’ACTH e a fenotipi di insufficienza surrenalica, a conferma della sua rilevanza per la ricerca in endocrinologia e nella segnalazione mediata da GPCR.

MC2-R Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di MC2R senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

MC2-R Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus MC2R nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione MC2R, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di MC2-R. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus MC2R nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da MC2-R nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via MC2-R nelle cellule tumorali con espressione di MC2R silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.