Plásmido CRISPR de Activación (h) MANEAL: sc-414652-ACT

MANEAL codifica una proteína asociada a membrana poco caracterizada, que se predice que se localiza en compartimentos del sistema endomembranoso y que podría contribuir al tráfico intracelular y al manejo de proteínas dentro de la vía secretora. Las anotaciones emergentes y las características de sus dominios sugieren posibles vínculos con el transporte RE–Golgi o con procesos de organización de membranas que influyen en la proteostasis y en las respuestas celulares al estrés. En consecuencia, MANEAL resulta de interés para estudiar cómo la dinámica del sistema endomembranoso moldea la regulación del estado celular, incluidos los programas de proliferación y diferenciación. Los patrones de expresión alterados reportados en diversos conjuntos de datos genómicos y transcriptómicos motivan investigar MANEAL como un modulador dependiente del contexto en fenotipos celulares relevantes para enfermedad, en particular en modelos donde la integridad de la vía secretora está perturbada.

MANEAL El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de MANEAL sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

MANEAL El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus MANEAL en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional MANEAL, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de MANEAL. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo MANEAL y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de MANEAL en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía MANEAL en células tumorales con expresión de MANEAL silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.