Plásmido CRISPR de Activación (h) MAMDC4: sc-414780-ACT

La MAMDC4 humana (MAM domain containing 4) codifica una proteína asociada a la membrana caracterizada por dominios MAM, que están implicados en interacciones célula–célula y célula–matriz. La expresión de MAMDC4 se ha relacionado con la diferenciación epitelial y con procesos asociados a la polaridad, en consonancia con funciones en la organización de redes de señalización y adhesión próximas a la membrana. Se han descrito niveles desregulados de MAMDC4 en múltiples contextos patológicos, incluidos programas transcripcionales asociados al cáncer, lo que la hace relevante para estudiar cómo los estados epiteliales alterados influyen en la proliferación, la migración y la organización tisular. Como factor de superficie y cercano a las uniones celulares, MAMDC4 se examina con frecuencia en modelos de biología de barrera y de plasticidad fenotípica de células tumorales.

MAMDC4 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de MAMDC4 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

MAMDC4 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus MAMDC4 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional MAMDC4, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de MAMDC4. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo MAMDC4 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de MAMDC4 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía MAMDC4 en células tumorales con expresión de MAMDC4 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.