MAGI-2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404260-ACT

MAGI2 codifica MAGI-2, una proteina scaffold con molteplici domini PDZ che si localizza alle giunzioni serrate e nei compartimenti sinaptici, dove organizza complessi di segnalazione e stabilizza l’adesione cellula-cellula. MAGI-2 coordina l’assemblaggio di recettori associati alla membrana e di adattatori del citoscheletro, influenzando l’integrità delle giunzioni, la polarità e le vie di trasduzione del segnale collegate alla funzione di barriera epiteliale e alla connettività neuronale. Attraverso il suo ruolo nell’ancorare fosfatasi e intermedi della segnalazione, MAGI-2 modula vie che incidono su proliferazione, differenziamento e dinamica della segnalazione sinaptica. La deregolazione di MAGI2 è stata associata ad alterazioni dell’architettura delle giunzioni e a reti di segnalazione anomale studiate in contesti di neuro-sviluppo e oncologia.

MAGI-2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di MAGI2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

MAGI-2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus MAGI2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione MAGI2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di MAGI-2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus MAGI2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da MAGI-2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via MAGI-2 nelle cellule tumorali con espressione di MAGI2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.