mAChR M5 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402943-ACT

CHRM5 kodiert den menschlichen muskarinischen Acetylcholinrezeptor M5 (mAChR M5), einen G‑Protein‑gekoppelten Rezeptor, der bevorzugt an Gq/11 koppelt und dadurch die Phospholipase‑C‑Signalübertragung, die Produktion von Inositolphosphaten, die Mobilisierung von intrazellulärem Ca2+ sowie die Aktivierung der Proteinkinase C stimuliert. Über diese Signalwege moduliert mAChR M5 die neuronale Erregbarkeit und die synaptische Transmission; je nach Zellkontext übernimmt er zudem Funktionen bei der Regulation des Gefäßtonus und bei sekretorischen Prozessen. Die durch CHRM5 gesteuerte Signalübertragung überschneidet sich mit MAPK/ERK‑ und anderen Second‑Messenger‑Netzwerken, die Genexpression und adaptive zelluläre Antworten prägen. Eine Fehlregulation cholinerger GPCR‑Signalwege wurde mit neuropsychiatrischen und neurodegenerativen Phänotypen sowie mit kardiometabolischen und entzündlichen Prozessen in Verbindung gebracht, was CHRM5 zu einem nützlichen Knotenpunkt für mechanistische Studien zur Kopplung von Signalwegen und zu rezeptorgesteuerten transkriptionellen Programmen macht.

mAChR M5 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CHRM5-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

mAChR M5 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CHRM5-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CHRM5-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen mAChR M5-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CHRM5-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von mAChR M5-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des mAChR M5-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CHRM5-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.