Plasmide CRISPR d'Activation (h) Ly-GDI/RhoGDI2/ARHGDIB: sc-402326-ACT

ARHGDIB code Ly-GDI (RhoGDI2), un inhibiteur de la dissociation du GDP des protéines Rho enrichi dans les cellules hématopoïétiques, qui se lie aux GTPases de la famille Rho prénylées et contrôle leur cycle d’association à la membrane ainsi que leur état d’activation. En modulant la signalisation de RAC1, RHOA et CDC42, ARHGDIB régule la dynamique du cytosquelette d’actine, l’adhérence cellulaire, la chimiotaxie et les réponses fonctionnelles des phagocytes, éléments centraux de la signalisation de l’immunité innée. Cette voie s’articule avec la motilité médiée par les intégrines et les réseaux de signalisation inflammatoire qui coordonnent le trafic leucocytaire et la surveillance des tissus. Une expression dysrégulée d’ARHGDIB a été associée à une migration altérée des cellules immunitaires et à des phénotypes inflammatoires, et elle est fréquemment étudiée dans le contexte de la biologie des hémopathies malignes et des interactions avec le microenvironnement tumoral.

Ly-GDI/RhoGDI2/ARHGDIB Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de ARHGDIB sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Ly-GDI/RhoGDI2/ARHGDIB Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus ARHGDIB dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription ARHGDIB, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Ly-GDI/RhoGDI2/ARHGDIB. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus ARHGDIB natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Ly-GDI/RhoGDI2/ARHGDIB au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Ly-GDI/RhoGDI2/ARHGDIB dans les cellules tumorales présentant une expression de ARHGDIB silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.