Lsh CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402466-ACT

Das humane Gen **HELLS** kodiert die lymphoidspezifische Helikase (Lsh), einen ATP-abhängigen Chromatin-Remodeler der SNF2-Familie, der mit DNA-Methyltransferasen zusammenwirkt, um die DNA-Methylierung und die Organisation von Heterochromatin zu etablieren und aufrechtzuerhalten. Lsh unterstützt die replikationsgekoppelte Chromatinassemblierung, die Silenzierung perizentromerer Wiederholungssequenzen sowie die Genomstabilität, indem es die Nukleosomenpositionierung und die höherstufige Chromatinstruktur reguliert. Über diese epigenetischen Funktionen beeinflusst HELLS Transkriptionsprogramme, die den Zellzyklusfortschritt und die Differenzierung steuern; eine Fehlregulation ist mit veränderten Methylierungslandschaften und Phänotypen genomischer Instabilität verbunden, wie sie in zahlreichen Krankheitskontexten beobachtet werden. HELLS wird daher breit in Signal- und Regulationswegen untersucht, die epigenetische Vererbung, Transposon-Repression und DNA-Reparatur-gekoppeltes Chromatin-Remodeling steuern.

Lsh Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen HELLS-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Lsh Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des HELLS-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der HELLS-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Lsh-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native HELLS-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Lsh-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Lsh-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem HELLS-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.