LONP1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-411273-ACT

LONP1 codifica la proteasi Lon AAA+ della matrice mitocondriale, un componente centrale del controllo qualità proteico mitocondriale che accoppia lo svolgimento dipendente dall’ATP alla proteolisi di proteine danneggiate o ripiegate in modo errato. Regolando il turnover delle subunità della catena respiratoria e dei fattori associati al nucleoide mitocondriale, LONP1 sostiene la fosforilazione ossidativa, il mantenimento del DNA mitocondriale e la risposta integrata allo stress mitocondriale. L’attività di LONP1 interseca vie che governano la proteostasi, l’omeostasi delle ROS e l’apoptosi, collegando la disfunzione mitocondriale a un metabolismo alterato e alle decisioni sul destino cellulare. Un’espressione o una funzione disregolata di LONP1 è stata associata a fenotipi di proteopatia mitocondriale ed è spesso studiata nel contesto della neurodegenerazione, del rimodellamento metabolico delle cellule tumorali e dei meccanismi delle malattie mitocondriali ereditarie.

LONP1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di LONP1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

LONP1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus LONP1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione LONP1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di LONP1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus LONP1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da LONP1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via LONP1 nelle cellule tumorali con espressione di LONP1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.