Plásmido CRISPR de Activación (h) LOC285636: sc-415435-ACT

C5orf51 (LOC285636) es un locus humano poco caracterizado que aparentemente codifica una proteína de baja abundancia, con anotación funcional limitada en las bases de datos actuales. Observaciones emergentes a nivel de transcritos sugieren una expresión dependiente del tipo celular y del contexto, lo que indica posibles funciones en redes reguladoras que modelan el estado celular más que en el metabolismo básico de mantenimiento. Como ocurre con muchos marcos de lectura abiertos no caracterizados, se han descrito patrones de expresión alterados en distintos conjuntos de datos procedentes de diversos contextos patológicos, lo que respalda su priorización para estudios mecanísticos de la regulación génica y la asociación con fenotipos. Definir la función de LOC285636 puede ayudar a cartografiar el control transcripcional aguas arriba y los efectos en vías aguas abajo relevantes para la proliferación, las respuestas al estrés y los programas de diferenciación celular.

LOC285636 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de C5orf51 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

LOC285636 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus C5orf51 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional C5orf51, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de LOC285636. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo C5orf51 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de LOC285636 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía LOC285636 en células tumorales con expresión de C5orf51 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.