Plásmido CRISPR de Activación (h) LIMK-1: sc-401057-ACT

LIMK1 codifica LIMK-1, una quinasa de serina/treonina que fosforila e inactiva a la cofilina para regular el recambio de los filamentos de actina y la remodelación del citoesqueleto. A través de la señalización de GTPasas de la familia Rho mediante las vías ROCK y PAK, LIMK-1 coordina cambios en la forma celular, la dinámica de adhesión y la motilidad, influyendo en procesos como el crecimiento de neuritas y la plasticidad sináptica. La actividad desregulada de LIMK-1 se ha vinculado con alteraciones en la dinámica de la actina observadas en modelos de invasión y metástasis de células cancerosas, así como con fenotipos del neurodesarrollo y cognitivos. Como efector de la remodelación de la actina, LIMK-1 se estudia con frecuencia en vías que controlan la migración, la mecanotransducción y la formación de fibras de estrés.

LIMK-1 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de LIMK1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

LIMK-1 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus LIMK1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional LIMK1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de LIMK-1. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo LIMK1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de LIMK-1 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía LIMK-1 en células tumorales con expresión de LIMK1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.