LDH-A Plasmídeo de ativação de CRISPR (r): sc-437361-ACT

A lactato desidrogenase A (LDH-A) é uma oxidoredutase citosólica que catalisa a interconversão entre piruvato e lactato, com a reciclagem concomitante de NADH/NAD⁺, sustentando a produção de ATP pela glicólise sob condições de alto fluxo glicolítico. Em células de rato, a atividade de LDH-A ajuda a manter o equilíbrio redox e a produção de lactato, influenciando o fluxo de carbono entre a glicólise e o metabolismo mitocondrial e contribuindo para as respostas celulares à hipóxia e ao estresse por nutrientes. O metabolismo do lactato dependente de LDH-A modula o microambiente metabólico e se cruza com vias que regulam proliferação, inflamação e estresse oxidativo. A expressão ou atividade desregulada de LDH-A é frequentemente estudada como uma característica de remodelação metabólica na biologia do câncer e em modelos de lesão tecidual isquêmica ou inflamatória.

LDH-A O Plasmídeo de Ativação CRISPR (r) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de sem alterar a sequência de ADN subjacente.

LDH-A O Plasmídeo de Ativação CRISPR (r) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição , onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de LDH-A. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de LDH-A no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via LDH-A em células tumorais com expressão de silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.