Plásmido CRISPR de Activación (h) KV1.4: sc-405990-ACT

KCNA4 codifica el canal de potasio humano dependiente de voltaje KV1.4, una subunidad α relacionada con Shaker que se ensambla en canales tetraméricos para mediar corrientes de K⁺ tipo A de inactivación rápida. Al modular la repolarización del potencial de acción, los intervalos entre disparos y la excitabilidad sináptica, KV1.4 contribuye al control dependiente de la actividad del potencial de membrana en tejidos excitables. La disponibilidad del canal y su compuerta se regulan mediante fosforilación e interacciones proteína–proteína que influyen en el tráfico y la estabilidad en la superficie celular, lo que vincula a KCNA4 con procesos de señalización más amplios que ajustan la excitabilidad neuronal y cardíaca. Las alteraciones en el equilibrio de corrientes de la familia KV1 se han asociado con fenotipos de señalización eléctrica desregulada relevantes para estudios de mecanismos arritmogénicos, susceptibilidad a crisis convulsivas y trastornos de la excitabilidad en sistemas modelo.

KV1.4 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de KCNA4 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

KV1.4 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus KCNA4 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional KCNA4, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de KV1.4. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo KCNA4 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de KV1.4 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía KV1.4 en células tumorales con expresión de KCNA4 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.