Plásmido CRISPR de Activación (h) KIBRA: sc-402677-ACT

WWC1 codifica KIBRA, una proteína de andamiaje enriquecida en cerebro y riñón que coordina la señalización en la corteza celular y en las sinapsis mediante dominios WW e interacciones de unión a PDZ. KIBRA participa en la regulación de la vía Hippo al modular la actividad de LATS1/2 y los programas transcripcionales de YAP/TAZ, conectando la polaridad celular, la proliferación y la mecanotransducción con el control transcripcional. También interactúa con reguladores del tráfico intracelular y del citoesqueleto de actina para influir en la dinámica de membrana y la plasticidad sináptica, con funciones descritas en rutas asociadas al aprendizaje y la memoria. La alteración de la expresión o de la señalización de WWC1/KIBRA se ha asociado con fenotipos neurocognitivos y con una desregulación del control del crecimiento relevante para la oncología y otros modelos de enfermedades complejas.

KIBRA El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de WWC1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

KIBRA El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus WWC1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional WWC1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de KIBRA. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo WWC1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de KIBRA en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía KIBRA en células tumorales con expresión de WWC1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.