Plásmido CRISPR de Activación (h) KANK4: sc-414866-ACT

El gen humano KANK4 (dominios de motivo KN y repeticiones de anquirina 4) codifica un adaptador del citoesqueleto que contribuye a la coordinación entre los microtúbulos corticales y la actina, así como a las interacciones célula–matriz. Mediante interacciones dependientes del motivo KN con miembros de la familia de las quinesinas y la unión a proteínas mediada por repeticiones de anquirina, KANK4 se vincula con la dinámica de las adhesiones focales, la polaridad celular y la migración direccional, procesos que determinan la arquitectura tisular y la mecanotransducción. Las proteínas de la familia KANK se han estudiado en vías que implican la señalización de GTPasas Rho, el recambio de adhesiones y la remodelación del citoesqueleto, lo que hace que KANK4 sea relevante para investigaciones sobre comportamiento invasivo y fenotipos de motilidad celular alterada. La expresión desregulada o la alteración genómica de reguladores del citoesqueleto/adhesión, incluido KANK4, se examina con frecuencia en biología del cáncer y en contextos del desarrollo en los que los programas de migración y adhesión están perturbados.

KANK4 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de KANK4 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

KANK4 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus KANK4 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional KANK4, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de KANK4. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo KANK4 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de KANK4 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía KANK4 en células tumorales con expresión de KANK4 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.