Plásmido CRISPR de Activación (m) IRG1: sc-421149-ACT

Acod1 en ratón codifica el gen 1 sensible a la respuesta inmunitaria (IRG1), una enzima mitocondrial inducida por la señalización de receptores tipo Toll y de interferón en macrófagos activados y otras células mieloides. IRG1 cataliza la producción de itaconato, un metabolito que reconfigura el inmunometabolismo celular al modular el ciclo del TCA, inhibir la succinato deshidrogenasa e influir en las especies reactivas de oxígeno y en programas antioxidantes dependientes de NRF2. A través de estas vías, Acod1 vincula la activación inflamatoria con una reprogramación metabólica que afecta la producción de citocinas y los estados antimicrobianos. La desregulación de la señalización IRG1–itaconato se ha asociado con respuestas inmunitarias innatas alteradas en contextos como infecciones, inflamación crónica y modelos de lesión tisular mediada por el sistema inmunitario.

IRG1 El plásmido de activación CRISPR (m) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de Acod1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

IRG1 El plásmido de activación CRISPR (m) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus Acod1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional Acod1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de IRG1. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo Acod1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de IRG1 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía IRG1 en células tumorales con expresión de Acod1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.