IRG1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-421149-ACT

O gene Acod1 de camundongo codifica o immune-responsive gene 1 (IRG1), uma enzima mitocondrial induzida por sinalização de receptores do tipo Toll e por interferons em macrófagos ativados e em outras células mieloides. O IRG1 catalisa a produção de itaconato, um metabólito que remodela o imunometabolismo celular ao modular o ciclo do TCA (ciclo do ácido tricarboxílico), inibir a succinato desidrogenase e influenciar as espécies reativas de oxigênio e programas antioxidantes dependentes de NRF2. Por meio dessas vias, o Acod1 conecta a ativação inflamatória a uma reprogramação metabólica que afeta a produção de citocinas e estados antimicrobianos. A desregulação da sinalização IRG1–itaconato tem sido associada a respostas imunes inatas alteradas em contextos como infecção, inflamação crônica e modelos de lesão tecidual mediada pelo sistema imune.

IRG1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Acod1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

IRG1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Acod1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Acod1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de IRG1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Acod1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de IRG1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via IRG1 em células tumorais com expressão de Acod1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.