Plásmido CRISPR de Activación (h) IRG1: sc-418001-ACT

El ACOD1 humano codifica IRG1, una enzima mitocondrial inducible que convierte el cis-aconitato en itaconato, conectando el metabolismo del ciclo de los ácidos tricarboxílicos (TCA) con la función efectora de la inmunidad innata. El itaconato modula el estado redox celular y la señalización inflamatoria al influir en respuestas antioxidantes dependientes de NRF2 y atenuar salidas proinflamatorias como la transcripción impulsada por NF-κB, reconfigurando así la activación de los macrófagos y los programas antimicrobianos. IRG1 se induce con fuerza aguas abajo de las vías de TLR y del interferón de tipo I durante infecciones e inflamación estéril, y su reprogramación metabólica converge con rutas que controlan las ROS, la señalización por succinato y la producción de citocinas. La actividad desregulada de ACOD1/IRG1 se ha estudiado en el contexto de enfermedades inflamatorias y de la biología de células mieloides asociadas a tumores, donde el estado inmunometabólico puede influir en el daño tisular y la inmunosupresión.

IRG1 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de ACOD1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

IRG1 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus ACOD1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional ACOD1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de IRG1. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo ACOD1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de IRG1 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía IRG1 en células tumorales con expresión de ACOD1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.