Plásmido CRISPR de Activación (h) INSIG-2: sc-402255-ACT

INSIG2 codifica INSIG-2, una proteína de membrana del retículo endoplásmico que limita la activación de la proteína de unión al elemento regulador de esteroles (SREBP) al favorecer la retención del complejo SCAP–SREBP en el RE en condiciones de abundancia de esteroles. Mediante este punto de control de detección de esteroles, INSIG-2 ayuda a coordinar la biosíntesis de colesterol y ácidos grasos con la disponibilidad de lípidos celulares y se relaciona con vías de ubiquitinación asociadas al RE que regulan enzimas metabólicas. La alteración de la expresión o la función de INSIG2 se ha vinculado con una lipogénesis y una homeostasis del colesterol desreguladas, con asociaciones descritas con fenotipos metabólicos que incluyen resistencia a la insulina, rasgos relacionados con la obesidad y acumulación de lípidos hepáticos. Como nodo de vía, INSIG-2 se utiliza ampliamente para estudiar el control transcripcional del metabolismo lipídico, el crosstalk entre estrés del RE y metabolismo, y la regulación por retroalimentación de los genes diana de SREBP.

INSIG-2 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de INSIG2 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

INSIG-2 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus INSIG2 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional INSIG2, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de INSIG-2. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo INSIG2 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de INSIG-2 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía INSIG-2 en células tumorales con expresión de INSIG2 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.