Plasmide CRISPR d'Activation (m) INDOL1: sc-431618-ACT

L’Ido2 murin code l’indoléamine 2,3-dioxygénase 2 (INDOL1), une enzyme dépendante de l’hème qui catalyse le clivage oxydatif du tryptophane en N‑formylkynurénine dans la voie de la kynurénine. En modulant la disponibilité intracellulaire du tryptophane et en générant des métabolites bioactifs de la kynurénine, INDOL1 influence la signalisation immunométabolique, l’équilibre rédox et les programmes géniques inflammatoires dans des contextes myéloïdes et épithéliaux. L’activité d’Ido2 a été étudiée en parallèle d’enzymes apparentées du catabolisme du tryptophane dans des mécanismes façonnant la présentation de l’antigène, des réponses de type tolérant et les réseaux de cytokines. Un flux dérégulé de la voie de la kynurénine et un métabolisme du tryptophane altéré sont associés à une dysfonction immunitaire et à des modèles de maladies liées à l’inflammation, ce qui fait d’Ido2 un nœud utile pour l’exploration de cette voie.

INDOL1 Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Ido2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

INDOL1 Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Ido2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Ido2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de INDOL1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Ido2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de INDOL1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie INDOL1 dans les cellules tumorales présentant une expression de Ido2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.