IMPDH2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-410835-ACT

Humanes IMPDH2 kodiert die Inosinmonophosphat-Dehydrogenase 2, ein geschwindigkeitsbestimmendes Enzym der de-novo-Biosynthese von Guanin-Nukleotiden, das IMP zu XMP umwandelt und zur Aufrechterhaltung zellulärer GTP-Pools beiträgt. Durch die Steuerung der Nukleotidverfügbarkeit unterstützt IMPDH2 die DNA-/RNA-Synthese, die Ribosomenbiogenese und die Proliferation und ist damit mit Programmen der metabolischen Umgestaltung verknüpft, die eine Immunaktivierung und onkogenes Wachstum begleiten. Die IMPDH2-Aktivität steht an der Schnittstelle des Purinstoffwechsels und übergeordneter Signalwege der Nukleotid-Homöostase, die Replikationsstressantworten und die Transkriptionskapazität beeinflussen. Eine veränderte Expression oder Abhängigkeit von IMPDH2 wurde in verschiedenen Krebsarten sowie im Kontext der Expansion von Immun- und Entzündungszellen beschrieben, was IMPDH2 zu einem nützlichen Knotenpunkt für die Untersuchung der metabolischen Regulation von Zellzuständen macht.

IMPDH2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen IMPDH2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

IMPDH2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des IMPDH2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der IMPDH2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen IMPDH2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native IMPDH2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von IMPDH2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des IMPDH2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem IMPDH2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.