Plasmide CRISPR d'Activation (m2) ILDR1: sc-430649-ACT-2

Chez la souris, le gène Ildr1 code le récepteur 1 contenant un domaine de type immunoglobuline (ILDR1), une protéine transmembranaire à passage unique enrichie au niveau des jonctions serrées tricellulaires, où elle contribue à organiser l’architecture de la barrière épithéliale et à réguler la perméabilité paracellulaire. ILDR1 participe à l’assemblage des jonctions et à des processus de signalisation liés à la polarité apico-basale et au trafic des protéines membranaires, soutenant une adhésion coordonnée cellule–cellule dans les tissus sensoriels et épithéliaux. L’altération de la fonction d’ILDR1 est associée à des défauts des jonctions serrées et à une physiopathologie auditive, faisant d’Ildr1 une cible pertinente pour étudier les mécanismes de la perte auditive et du dysfonctionnement de la barrière épithéliale. L’édition génétique de Ildr1 chez la souris permet d’interroger in vivo et in vitro la biologie des jonctions tricellulaires, la régulation tissulaire spécifique des barrières, ainsi que les changements transcriptomiques ou protéomiques en aval dans des modèles de développement de l’épithélium sensoriel et de réponses au stress pertinentes pour la maladie.

ILDR1 Le plasmide d'activation CRISPR (m2) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Ildr1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

ILDR1 Le plasmide d'activation CRISPR (m2) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Ildr1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Ildr1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de ILDR1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Ildr1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de ILDR1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie ILDR1 dans les cellules tumorales présentant une expression de Ildr1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.