IKKβ CRISPR Activation Plasmid (m): sc-421074-ACT

Ikbkb kodiert die Beta-Untereinheit der Inhibitor-of-Nuclear-Factor-κB-Kinase (IKKβ), eine katalytische Kernkomponente des IKK-Komplexes, der IκB-Proteine phosphoryliert und dadurch die nukleäre Translokation von NF-κB sowie entsprechende Transkriptionsprogramme auslöst. In Mauszellen integriert IKKβ Signale vom TNF-Rezeptor, IL-1-Rezeptor und von Mustererkennungsrezeptoren, um angeborene Immunität, die Produktion inflammatorischer Zytokine, Zellüberleben und Stressantworten zu koordinieren. Diese Kinase steht außerdem in Wechselwirkung mit der MAPK-Signalgebung und der metabolischen Regulation, unter anderem durch Crosstalk mit insulin- und mTOR-gekoppelten Signalwegen. Eine dysregulierte IKKβ–NF-κB-Signalgebung wird in Studien zu chronischer Entzündung, Autoimmunität, Infektionen und tumorassoziierten Signalwegen häufig als mechanistisches Modell verwendet, ohne dass damit therapeutische Wirkungen impliziert werden.

IKKβ Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Ikbkb-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

IKKβ Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Ikbkb-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Ikbkb-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen IKKβ-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Ikbkb-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von IKKβ-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des IKKβ-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Ikbkb-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.