Ihh CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401466-ACT

Indian hedgehog (IHH) kodiert das sezernierte Morphogen Ihh, einen Liganden der Hedgehog-Familie, der Zellschicksalsentscheidungen und die Musterbildung von Geweben reguliert, indem er die PTCH1/SMO-Signalübertragung und die GLI-abhängige Transkription aktiviert. Ihh ist ein zentraler Koordinator der enchondralen Ossifikation, der Proliferation und Hypertrophie von Chondrozyten sowie der Osteoblastendifferenzierung und integriert sich in Entwicklungsprogramme, die das Skelettwachstum formen. Eine fehlregulierte Aktivität des IHH-Signalwegs ist mit einer abnormen Knorpel- und Knochenentwicklung verbunden und wurde an Krankheitsprozessen beteiligt, die mit einem Ungleichgewicht der Hedgehog-Signalübertragung einhergehen. Da Hedgehog-Outputs mit WNT-, BMP- und MAPK-Signalen zusammenlaufen, wird IHH häufig als upstream treibender Faktor der Differenzierung und der Mikroumgebungs-Signalgebung in muskuloskelettalen und entwicklungsbiologischen Modellen untersucht.

Ihh Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen IHH-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Ihh Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des IHH-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der IHH-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Ihh-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native IHH-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Ihh-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Ihh-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem IHH-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.