Plasmide CRISPR d'Activation (m) IDH1: sc-421022-ACT

L’Idh1 murin code l’isocitrate déshydrogénase cytosolique 1 (IDH1), une enzyme dépendante du NADP+ qui catalyse la décarboxylation oxydative de l’isocitrate en α‑cétoglutarate tout en générant du NADPH. En maintenant les réserves de NADPH, IDH1 soutient les systèmes rédox glutathion/thioredoxine, la biosynthèse lipidique et les réponses cellulaires au stress oxydant. L’activité d’IDH1 relie le métabolisme central du carbone aux voies épigénétiques et de détection de l’oxygène via la disponibilité de l’α‑cétoglutarate pour les dioxygénases, influençant la déméthylation de l’ADN/des histones et la signalisation de l’hypoxie. La dérégulation du métabolisme dépendant d’IDH1 est pertinente pour l’étude du remodelage métabolique oncogénique, des déséquilibres rédox et des changements d’état de lignée dans les tissus prolifératifs et en différenciation.

IDH1 Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Idh1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

IDH1 Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Idh1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Idh1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de IDH1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Idh1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de IDH1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie IDH1 dans les cellules tumorales présentant une expression de Idh1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.