ICSBP CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400774-ACT

Das humane IRF8-Gen kodiert das Interferon-Consensus-Sequenz-bindende Protein (ICSBP), einen auf hämatopoetische Zellen beschränkten Transkriptionsfaktor, der mit Partnern aus den IRF- und ETS-Familien kooperiert, um die Spezifikation myeloider und B-Zell-Linien, die Antigenpräsentation sowie Programme interferon-stimulierter Gene zu regulieren. ICSBP integriert Signale aus Interferon-, TLR- und Zytokin-Signalwegen und formt dadurch angeborene und adaptive Immunantworten, einschließlich der Aktivierung von Makrophagen und der Differenzierung dendritischer Zellen. Eine fehlregulierte IRF8-Aktivität wurde mit veränderter Entwicklung von Immunzellen, inflammatorischen Phänotypen und einer erhöhten Anfälligkeit für immunvermittelte Erkrankungen in Verbindung gebracht und wird häufig im Kontext der Biologie hämatologischer Malignome untersucht. Als zentraler Regulator transkriptioneller Netzwerke bietet IRF8 einen gut zugänglichen Ansatzpunkt, um genregulatorische Schaltkreise zu analysieren, die die Immunhomöostase steuern.

ICSBP Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen IRF8-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

ICSBP Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des IRF8-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der IRF8-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen ICSBP-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native IRF8-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von ICSBP-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des ICSBP-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem IRF8-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.