Plásmido CRISPR de Activación (h) ICMT: sc-406029-ACT

La ICMT humana (isoprenilcisteína carboxil metiltransferasa) es una enzima localizada en el retículo endoplásmico que cataliza la metilesterificación de las prenilcisteínas C-terminales en proteínas con motivo CAAX tras la prenilación y la proteólisis. Este paso de procesamiento posterior a la prenilación modula la afinidad por membranas, el tráfico subcelular y la salida de señalización de múltiples sustratos prenilados, incluidas pequeñas GTPasas implicadas en vías de respuesta a factores de crecimiento y al estrés. Al moldear la localización y la función de proteínas de señalización preniladas, la ICMT conecta las redes de modificación lipídica con la regulación de la proliferación, la diferenciación y la dinámica del citoesqueleto. La señalización dependiente de la prenilación desregulada se ha asociado con la transformación oncogénica y otros trastornos de la señalización celular y de la deslocalización de proteínas, lo que convierte a la ICMT en un nodo útil para estudios mecanísticos.

ICMT El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de ICMT sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

ICMT El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus ICMT en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional ICMT, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de ICMT. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo ICMT y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de ICMT en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía ICMT en células tumorales con expresión de ICMT silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.