ICMT CRISPR Activation Plasmid (h): sc-406029-ACT

Humanes ICMT (Isoprenylcystein-Carboxylmethyltransferase) ist ein im endoplasmatischen Retikulum lokalisiertes Enzym, das nach Prenylierung und Proteolyse die Methylesterifizierung der C‑terminalen Prenylcysteine von CAAX-Motiv-Proteinen katalysiert. Dieser Post-Prenylierungs‑Prozessschritt moduliert die Membranaffinität, den subzellulären Transport und den Signaloutput mehrerer prenylierter Substrate, darunter kleine GTPasen, die an Wachstumsfaktor- und Stressantwort-Signalwegen beteiligt sind. Indem ICMT die Lokalisierung und Funktion prenylierter Signalproteine prägt, verknüpft es Netzwerke lipidischer Modifikationen mit der Regulation von Proliferation, Differenzierung und Zytoskelettdynamik. Eine fehlregulierte prenylierungsabhängige Signalübertragung wird mit onkogener Transformation und anderen Störungen der Zellsignalgebung sowie der Proteinfehl-Lokalisierung in Verbindung gebracht, wodurch ICMT einen nützlichen Ansatzpunkt für mechanistische Studien darstellt.

ICMT Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ICMT-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

ICMT Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ICMT-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ICMT-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen ICMT-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ICMT-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von ICMT-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des ICMT-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ICMT-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.