Plasmide CRISPR d'Activation (h) HYPE: sc-406626-ACT

Le gène humain **FICD** code **HYPE**, une enzyme à domaine Fic localisée dans le réticulum endoplasmique (RE) qui catalyse l’AMPylation et la dé-AMPylation réversibles de substrats protéiques, notamment la chaperonne **HSPA5/BiP**. En modulant l’activité de BiP, HYPE façonne la protéostasie du RE, la signalisation de la réponse aux protéines mal repliées (UPR) et des programmes adaptatifs de stress qui influencent la capacité de repliement des protéines et la sécrétion. Cet axe de régulation relie FICD à des voies contrôlant l’homéostasie du RE, la gestion du calcium et la survie cellulaire en situation de stress protéotoxique. Un stress du RE et une signalisation UPR dérégulés sont impliqués dans la neurodégénérescence, les dysfonctions métaboliques et des phénotypes liés au cancer, faisant de **FICD/HYPE** un nœud pertinent pour des études mécanistiques de la protéostasie.

HYPE Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de FICD sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

HYPE Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus FICD dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription FICD, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de HYPE. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus FICD natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de HYPE au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie HYPE dans les cellules tumorales présentant une expression de FICD silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.