Plásmido CRISPR de Activación (m) HXK II: sc-420866-ACT

Mouse Hk2 codifica la hexoquinasa II (HXK II), una enzima limitante de la velocidad que fosforila la glucosa a glucosa-6-fosfato en el punto de entrada de la glucólisis, controlando así el flujo de carbono hacia la producción de energía y las vías biosintéticas. La función de HXK II vincula la utilización de la glucosa con el metabolismo mitocondrial y puede influir en el equilibrio entre la glucólisis y la fosforilación oxidativa, con efectos posteriores sobre la generación de ATP, la homeostasis redox y el suministro de precursores anabólicos. En muchos tipos celulares, la expresión de HK2 está regulada por redes de señalización sensibles a nutrientes y factores de crecimiento, incluidas las vías PI3K–AKT y programas dependientes de HIF que coordinan la adaptación metabólica. Las alteraciones en la actividad y la expresión de HK2 se utilizan ampliamente como indicadores de reprogramación metabólica relevante para estados proliferativos y de adaptación al estrés en modelos de inflamación, neurodegeneración y biología tumoral.

HXK II El plásmido de activación CRISPR (m) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de Hk2 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

HXK II El plásmido de activación CRISPR (m) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus Hk2 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional Hk2, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de HXK II. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo Hk2 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de HXK II en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía HXK II en células tumorales con expresión de Hk2 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.